操作步骤 一、病毒诊断用病料的采集 病毒分离用生物学材料的最理想的采集时期，是在机体尚未产生抗体之前的疾病急性期。
各种病料，例如血液、鼻咽拭子、粪、尿、脓汁、水泡液、皮肤病变、脊髓液和活体穿刺材料以及剖检时采取的组织，均可用于病毒分离。每个具体疾病需要采取什么样的生物标本，可参考有关疾病的叙述，特别是其诊断部分。
有一些总的规则适用于病毒分离用的组织的正确选择。呼吸道疾病在急性期，通常在鼻或咽分泌物排出病毒。在痘病的水泡液中或痂皮内也可发现病毒。许多全身性卡他性疾病具有病毒血症期，易于由血液中分离到病毒。实际上急性发病期间，机体的所有分泌物中都含有病毒。与中枢神经系统有关的疾病较特殊，但也可由血液或病死动物的脑内分离病毒。采取组织标本时一个最为重要的注意事项，就是必须在动物死亡后立即进行--必要时可扑杀濒死动物，就更有利于病毒分离。同时应采取该动物血液作血清学试验,在冰冻前必须先从全血中分离血清，因为溶血标本经常不再能做某些血清学试验。
各种病毒的生物物理学和生物化学特性明显不同。许多病毒对热及酸敏感，故在采集材料时必须特别注意。尤其是必须采取新鲜材料，并立即置-60℃至-70℃下冰冻。此外，在用这些病料接种组织培养物或试验动物分离病毒时，时间尽量要短。如无其他方法，可将组织标本低温冰冻后置-20℃保存，等待取来干冰后再贮藏和送往实验室。将标本放入宽口保温瓶或以泡沫苯乙烯隔热的纸板盒内，再用冰充填，也可达到这一目的。如果没有干冰，则可应用50%甘油;某些病毒在此种溶液中能比其他一些病毒存活更久。将小块组织、粪或粘液装入小瓶内，再向瓶内注满50%甘油，并贮存于6℃。
组织标本应以无菌器械在无菌条件下采取。如果想要了解组织中的病毒分布，则必须应用分开的器械采取每个组织。经常应用紧盖的灭菌旋帽瓶子贮存可疑的组织和液体。如将液体标本瓶放入干冰内，则应紧盖瓶塞，因干冰的气相就是CO2，CO2可因改变液体的pH值使不耐酸的病毒灭活。如果瓶盖漏气，则将其放入密封的塑料袋内也可达到目的。
二、包涵体的检查 用狂犬病脑切片的内基氏(Negri)小体或其他包涵体标本片示教。若有狂犬病的病料组织，可用清洁的玻片作触片，干燥后置甲醇中固定，以姬姆萨氏染液染1小时，水洗，干燥，镜检。
通常可用塞勒(Seller)氏染色法检查狂犬病的包涵体。
(一)塞勒氏染液配制 1.先配好1%美兰(即亚甲蓝)的纯甲醇溶液和1%碱性复红(即碱性一品红)的纯甲醇溶液。两液分别置瓶中加塞塞紧后，于冷处可长期保存。
2.用前将两份美兰液与一份复红液混合，即为塞勒氏染液。用前试验，以神经组织间质染成淡红色为妥，若红色过浅酌加复红液，红色过深酌加美兰液。
(二)塞勒氏染色法将新鲜脑组织触片(触片不干也可以)浸于塞勒氏染液3秒钟，取出，用普通水冲洗，自然干燥后镜检。
(三)结果狂犬病包涵体在神经组织的胞质中，嗜酸性，呈樱桃红色。嗜碱性组织与细胞核呈深蓝色，神经细胞质呈蓝紫色，间质呈粉红色，神经纤维呈桃红色，神经鞘不着色(见图实20-1)。
三、鸡胚接种 (一)鸡蛋选择和孵化选健康无病鸡群的新鲜受精蛋。鸡胚对所要接种的病毒应无免疫力，因为其抗体可由母鸡经卵黄而传给胚胎。以来航鸡蛋或其它白壳蛋为好，因为白壳蛋照蛋时较易于观察。孵化时以孵卵箱较好，培养细菌的温箱也可以用，但和孵小鸡一样，特别要求温度、翻蛋和湿度适当相对湿度为60%左右，所用温度和孵小鸡相似，但最低可用36℃，一般37.5℃，高可到38.5℃，每日翻蛋最少3次，开始可以将鸡蛋横放，要接种的前两天立放，气室向上，接种前两天特别注意鸡胚位置，希望近中央，不要过分偏在一边，胚胎偏在一边易死亡。接种前两天若发现过分偏在一边，照蛋后将偏在一边的胚胎朝下放，可以矫正到鸡胚趋向中央。
孵化三、四天，可用照蛋灯在暗室观察，鸡胚发育处的血管即明显可见。没有鸡胚发育也无血管的是未受精蛋。有鸡胚但鸡胚固定一处不动且血管消散呈暗红色者是死胚。活的鸡胚，血管及其主要分枝均明显，呈鲜红色，鸡胚可以活动。实验室接种用的鸡胚最小是6日龄，最大是12、13日龄。此时鸡胚构造如图20-2所示。
(二)接种前准备 1.病毒的接种材料事先应经无菌检验，即接种到一管硫羟代乙酸肉汤(或肉汤、熟肉培养基各一管)不生长。要达到材料无菌，可采取以下措施: (1)所取材料应无菌，处理(如研磨、离心取上液等)过程中也无细菌污染; (2)如所取材料已污染，可在每ml材料中加青霉素和链霉素各达1000~5000单位(常用1000~2000单位)，置室温中1小时或冰箱中12~24小时处理。或经滤器除菌。
2.照蛋，以铅笔划出气室、胚胎的位置，若要做卵黄囊接种或血管注射，还要划出相应的部位。
3.用碘酒在接种处的蛋壳上消毒，并在该处开孔。
(三)鸡胚接种方法鸡胚接种的方法很多，此仅列举其中较常用的一些方法。同时，当列举的接种途径有几种技术时，也仅选择其中最广泛应用的一种。图20-31.卵黄囊(Yolksac)接种:大型的原生小体性病毒和立克次氏体易在卵黄囊膜内生长。虽然许多较小的病毒也可用卵黄囊途径接种，但这些病毒主要侵害胚胎本身并在胚胎组织内增殖，而不是侵害卵黄囊组织和在其中增殖。
(1)日龄和准备孵化5~7天的鸡胚较为适用，因为此时的卵黄囊较大。在检蛋灯上检蛋，并用铅笔画出气室的边缘。气室部分的蛋壳称为壳帽，待碘酊干后，在天然气室的正中处用钻钻一个孔。
(2)接种和孵育应用装有2.54cm长的8号针头的注射器，将针头全长穿过壳帽上的孔直向下插(与鸡蛋的长轴平行)，并把接种物注入卵黄囊内。通常接种0.2~0.5ml。随后用石蜡--凡士林混合物封闭蛋壳孔，并将鸡蛋置37℃孵育。
(3)收获程序收获时将蛋直立于蛋盘内。用无菌镊子打碎蛋壳，并将壳帽除去。将暴露的膜撕去，并用去掉了嘴的灭菌10ml吸管吸取卵黄。如需收获卵黄囊膜，可将蛋内容物迅速倾于一个灭菌平皿内。卵黄囊常在操作时破裂。卵黄囊呈深黄色，易于识别。用无菌镊子将卵黄囊与绒毛尿囊膜分开，并与胚胎剥离，迅速移置于一个灭菌平皿内。如欲收获鸡胚胎，可用弯头牙科探针钩住胚胎的颈部取出之，并用无菌剪刀剪去附着的膜后移置于灭菌平皿内。
2.尿囊腔(Allantoiccarity)接种流感病毒和新城疫病毒以及引起呼吸道感染的其他多数病毒都易在尿囊壁的内胚层细胞内生长，并释出于尿囊液中。脑脊髓炎病毒和流行性腮腺炎病毒在用这个途径接种时也易增殖。
(1)日龄和准备取孵化8~11天的鸡胚，检蛋，并用铅笔画出气室边缘。将蛋直立，气室向上。在鸡蛋的侧面离气室底上方几毫米、绒毛尿囊膜发育良好处选好一点。用碘酊消毒该点及其周围部分，在蛋壳上用钻钻一个孔或用针穿刺一个孔。
(2)接种和孵育取一长1.3cm的7号针头，接在吸有接种物的小注射器上，通过蛋壳上的钻孔，与鸡蛋长轴平行地或者呈一定角度地将针插入尿囊腔内。每个蛋注射0.2~0.5ml的接种物。随后用热的石蜡-凡士林混合物封闭蛋壳上的钻孔。将蛋置37℃孵育。
(3)尿囊液的收获为使收获时不致因出血而有血液流到尿囊液内，可在收获前将鸡胚置冰箱内冷藏4~6小时。将鸡胚直立放置并用无菌镊子除去气室上的蛋壳、暴露气室底。气室底由敷覆在绒毛尿囊膜上的内壳膜构成。用一把弯头小剪将这些膜撕去。为了便于采集尿囊液，可置入一把镊子，使其尖端朝向蛋壳，将胚胎挤向一侧。此时即可应用5或10ml灭菌吸管吸取尿囊液。
3.绒毛尿囊膜(Chorioallantoicmembrane)接种 (1)日龄和准备取9~11日龄的鸡胚，检蛋，并用铅笔在血管最丰富处的蛋壳上画出一个lcm2的区域,应用5%石炭酸消毒蛋壳，待其干燥。不用碘酊消毒，因为酒精溶液可经蛋壳吸收，并在绒毛尿囊膜上产生病变，可能被误认为是由病毒引起的。用钻子沿蛋壳上的铅笔线钻开。必须十分小心，切勿弄破内壳膜。随后在天然气室上，象上述卵黄囊接种法那样的钻孔或刺孔。将蛋平放，使钻开一小块蛋壳的一侧向上。用尖头镊子或牙科探针轻轻地将已钻开的蛋壳取去。此时暴露出内壳膜，它的下面就是绒毛尿囊膜。滴上一滴无菌生理盐水，使内壳膜软化。取一长约0.64cm的7号针头连接于l个lml注射器上，使针头尖的斜面以45°角接触这个已软化的内壳膜部分，稍稍向下一压，即可因牵引而在内壳膜上造成一个裂缝。必须注意不要损伤下层的绒毛尿囊膜。因为内壳膜的纤维斜向行走，所以应使注射器与鸡卵长轴呈45°角，这样向下一压，就可将纤维分离而不撕断。随后用橡皮球在天然气室的钻孔上吸气。也可以在吸气前先在裂缝上滴加一滴灭菌盐水。吸入的盐水可以帮助绒毛尿囊膜与内壳膜分开。当部分鸡蛋内容物向原来的天然气室部分转移时，绒毛尿囊膜即塌落。绒毛尿囊膜与内壳膜分离和绒毛尿囊膜塌落的证据，就是内壳膜变为透明。